一、原理 本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氯霉素和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗氯霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氯霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較可得出相應(yīng)殘留物氯霉素的含量。 二、試劑盒技術(shù)指標(biāo) 試劑盒靈敏度： 0.05ppb 樣本定量檢測(cè)下限： 腸 衣————————————————0.1ppb 蜂 蜜———————————————— 0.1ppb 牛 奶————————————————0.05ppb 尿液、血清——————————————0.1ppb 組織、肝臟————————————— 0.025ppb 飼 料———————————————0.15ppb 樣本回收率： 組織、肝臟—————————————80%±10% 蜂蜜、腸衣—————————————70%±10% 牛奶、飼料—————————————85%±15% 尿液、血清———————————————70%±10% 交叉反應(yīng)率 氯霉素———————————————————100% 甲砜霉素————————————————— < 0.1% 氟甲砜霉素————————————————< 0.1% 三、 試劑盒組成 1、 微量測(cè)試孔：每條8孔，一板12條 2、 標(biāo)準(zhǔn)液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb 3、 酶標(biāo)記物 12ml………………紅色帽 4、 抗體濃縮液 1ml…………………藍(lán)色帽 5、 底物 A 液 7ml……………… 白色帽 6、 底物 B 液 7 ml……………… 黑色帽 7、 終止液 7 ml……………… 黃色帽 8、 20X濃縮洗滌液 40ml………………白色帽 9、 2X濃縮復(fù)溶液 50ml………………透明帽 四、所用儀器、試劑 具備的儀器：微孔板酶標(biāo)儀、氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g ） 微量移液器：?jiǎn)蔚?/span> 20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl 試 劑：乙酸乙酯、乙腈、正己烷、去離子水、亞硝基鐵、硫酸鋅、葡萄糖苷酸酶（Merck,Art.No.4114）、醋酸鈉、醋酸 五、樣本前處理步驟 樣本處理前須知 處理任何樣本時(shí)，都必須注意： （a）本試劑盒所檢測(cè)的組織樣本包括：動(dòng)物組織、 禽類(lèi)和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚(yú)、蝦等。 （b）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。 （c）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 樣本前處理需配制： 配液1、C液（牛奶樣本使用）： 0.36M 亞硝基（Na2Fe（CN）5·NO·2H2O）10.7g亞硝基鐵加去離子水100ml溶解。 配液2、D液（牛奶樣本使用）： 1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解。 配液3、 pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液（尿樣本使用）：稱(chēng)2.4g醋酸鈉和1.2ml醋酸加去離子水500ml溶解混合。 配液4、乙腈-水溶液 V乙腈：VH2O＝84：16 配液5、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。（1份濃縮復(fù)溶掖+1份去離子水，用于抗體的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶）。 （a）組織、肝臟樣本前處理方法 1、 用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本； 2、 稱(chēng)3±0.05g樣本于離心管中，先加入3ml去離子水充分混勻再加入6ml乙酸乙酯，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min； 3、 取出4ml上層液體在氮?dú)饬?0-60℃水浴中干燥； 4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。 5、 取50 µl下層相用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：0.5 （b）血清血漿 1、 取1ml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯振蕩1min； 2、 靜置使水相與有機(jī)相分層或室溫4000r/min離心5min； 3、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮?dú)饬?0℃水浴中干燥； 4、 殘留物用1 ml稀釋后的復(fù)溶液溶解，混合30s； 5、 取50µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：1 （c）尿液 1、 移取2ml尿液到離心管中，加pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液0.5ml混合； 2、 加40µl葡萄糖苷酸酶（Merck,Art.No.4114）到稀釋的尿液中，在37℃水解至少2小時(shí)（或過(guò)夜）； 3、 該溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯混合1min； 4、 室溫4000r/min離心10min，取出4ml上層液體在氮?dú)庀?0～60℃干燥； 5、 用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s； 6、 取50µl 用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：1 （d）蜂蜜 1、 取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中，用4ml 去離子水溶解； 2、 加入4ml乙酸乙酯上下振蕩5min； 3、 室溫4000r/min以上離心10min； 4、 移取2ml上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮?dú)饬飨赂稍铮?/div> 5、 用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解，混合30s； 6、 取50 µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：0.5 檢測(cè)下限：0.025ppb 定量下限：0.1 ppb 注：我們推薦0.1 ppb為陽(yáng)性樣本的cut off值。 （e）腸衣 1、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本注：干樣本需剪碎（長(zhǎng)度不超5mm）后再均質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂洗20min以上（去除表面的鹽份），瀝干后再進(jìn)行均質(zhì)。 2、 稱(chēng)1±0.05g均質(zhì)后的樣本于離心管中，加入10ml乙酸乙酯，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min。 3、 取出5ml上層液體（相當(dāng)于0.5g的樣本）在氮?dú)饬飨?0-60℃干燥。 4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上，離心5min。 5、 去上層相，取下層50 µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：1 （f）牛奶和奶粉 牛奶樣本處理方法一 1、 牛奶樣本，10℃4000r/min以上離心10min，吸除上層脂肪； 2、 取5ml去除脂肪奶樣至離心管中，加入150µlC液出現(xiàn)沉淀，短暫振蕩后加入150µlD液混合； 3、 15℃4000r/min以上，離心10min，移取上層液； 4、 用稀釋后的復(fù)溶液以等體積稀釋上層液，混合30s； 5、 取50µl用于分析。 注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過(guò)程。 樣本稀釋倍數(shù)：2 檢測(cè)下限：0.1ppb 定量下限：0.15ppb 牛奶樣本處理方法二 1、 取5ml去除脂肪奶樣至離心管中； 2、 加入250µlC液和250µlD液*混合，4-12℃4000r/min以上離心10min。如果沒(méi)有冷凍離心機(jī)，請(qǐng)預(yù)先將樣本冷卻到8℃； 3、 轉(zhuǎn)移出2.2ml上層液（相當(dāng)于2ml奶樣）至一 個(gè)新的離心管中，加入4ml乙酸乙酯上下振蕩5min； 4、 室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min ； 5、 轉(zhuǎn)移出2ml乙酸乙酯上層液體（相當(dāng)于1ml奶樣），60℃氮?dú)饬飨?干燥； 6、 用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s； 7、 取50µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：0.5 檢測(cè)下限：0.025ppb 定量檢測(cè)限：0.05ppb 由于陰性樣本可能會(huì)產(chǎn)生背景干擾 （在某些 情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3作為陽(yáng)性結(jié)果的CUT OFF判斷值。 奶粉樣本處理方法 1、 稱(chēng)2±0.05 g奶粉至離心管中，加入10ml去離子水，振蕩溶解； 2、 加1ml C液和1ml D液*混合。4-12℃4000r/min以上離心10min。若無(wú)冷凍離心機(jī)，請(qǐng)預(yù)先將樣本冷卻到8℃； 3、 轉(zhuǎn)移出3.6ml上層液（相當(dāng)于0.6g奶粉）至一 個(gè)新的離心管中，加入6ml乙酸乙酯上下來(lái)回 振蕩5min； 4、 室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min； 5、 轉(zhuǎn)移出4ml乙酸乙酯上層液體（相當(dāng)于0.4g奶粉），60℃氮?dú)饬飨?干燥； 6、 用0.4ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s； 7、 取50µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測(cè)下限：0.05ppb 定量檢測(cè)限：0.15ppb 由于陰性樣本可能會(huì)產(chǎn)生背景干擾 （在某些情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3作為陽(yáng)性結(jié)果的CUT OFF判斷值。 （g）蛋類(lèi) 1、 用均質(zhì)器低速均質(zhì)樣本（蛋黃或全蛋）； 2、 稱(chēng)取3±0.05 g均質(zhì)過(guò)的樣本，與9ml乙腈-水溶液（84︰16；V乙腈︰V水）振蕩5min，15℃ 4000r/min以上離心10min； 3、 取3ml上層與3ml蒸餾水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯混合5min，15℃4000r/min以上離心10min； 4、 將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到試管中50℃下氮?dú)獯蹈桑?/div> 5、 加入1ml正己烷溶解殘留物后，用2ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除正己烷。 6、 取50µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：2 檢測(cè)下限：0.1ppb 定量檢測(cè)限：0.3ppb （h）飼料 1、 稱(chēng)取2±0.05g均質(zhì)過(guò)的飼料樣本，加入2ml去離子水，再加入6ml乙酸乙酯，充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min； 2、 取2ml上層有機(jī)相到試管中56℃下氮?dú)獯蹈桑?/div> 3、 加入1ml正己烷溶解殘留物，用1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷。 4、 取50µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：3 檢測(cè)下限：0.15ppb 六、 酶標(biāo)免疫分析程序 測(cè)定前應(yīng)須知： 1、 使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。 2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。 3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。 4、 在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線(xiàn)照射，用蓋板膜封住微孔板。 操作步驟 1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。 2、 取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。 3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋?zhuān)?/span>1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。 4、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。 5、 將濃縮抗體用已稀釋好的復(fù)溶液11倍稀釋?zhuān)?/span>1份抗體加入10份稀釋液，按需配制使用） 6、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。 7、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。 8、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。 9、 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。 10、測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。 七、結(jié)果判定 結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含氯霉素成反比。 1、 粗略判定： 用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍（ppb）。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.250，樣本2的吸光度值為0.720，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.610；0.05ppb為1.380；0.15ppb為1.100；0.45ppb為0.620；1.35ppb為0.289；4.05ppb為0.108。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb-4.05ppb；樣本2的濃度范圍是0.15 ppb-0.45 ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實(shí)際濃度。 2、 定量分析 （1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即 B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值 （2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實(shí)際濃度。若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?/span> 八、注意事項(xiàng) 1、 室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫 （20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。 2、 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3、 試劑混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。 4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。 5、 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。 6、 將不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線(xiàn)下。 7、 試劑變質(zhì)的跡象 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。 8、 該試劑盒*反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。 九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。 提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)放心使用。 |
