重組蛋白在宿主系統(tǒng)中高水平表達(dá)時(shí)，無論是原核表達(dá)體系或真核表達(dá)體系甚至高等真核表達(dá)體系，都會形成包涵體[2]。主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過程中，缺乏某些蛋白質(zhì)折疊過程中需要的酶和輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的[3]。 1、 表達(dá)量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。 2、 重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。 3、 所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。 4、 是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。 5、 有報(bào)道認(rèn)為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時(shí)，容易形成包涵體。 減少包涵體形成的策略 1、 降低重組菌的生長溫度，降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的zui常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成[4]。 2、 添加可促進(jìn)質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑，培養(yǎng)E.coli時(shí)添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質(zhì)的蛋白質(zhì)聚集反應(yīng)，在zui適濃度范圍內(nèi)添加這些添加劑不會影響細(xì)胞的生長、蛋白質(zhì)的合成或運(yùn)輸，其它促質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑還有乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl[5]。 3、 供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造*培養(yǎng)條件，如供氧、pH等。 包涵體的分離及溶解 對于生物制藥工業(yè)來說，包涵體的形成也是有利的，不僅可獲得高表達(dá)、高純度的質(zhì)，還可避免細(xì)胞水解酶對質(zhì)的破壞。由于包涵體是蛋白質(zhì)聚集而成的致密顆粒，分離的*步是對培養(yǎng)收集的細(xì)胞進(jìn)行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結(jié)合溶菌酶處理，然后5000~20000g離心，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離，接著，包涵體沉淀需用去污劑（Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會導(dǎo)致包涵體溶解和復(fù)性的過程中質(zhì)的降解. 包涵體的溶解必須用很強(qiáng)的變性劑，如8mol/L尿素、6~8mol/L鹽酸胍，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氰鹽酸胍zui強(qiáng)；去污劑，如SDS[7]，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法*去除而不允許用在制藥行業(yè)中；酸，如70%甲酸，可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數(shù)蛋白質(zhì)。對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時(shí)應(yīng)加入還原劑（如DTT、GSH、β-ME）打開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，對于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵的有時(shí)也應(yīng)使用還原劑，為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時(shí)還應(yīng)加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)。 |
