半抗原是指本身無免疫原性，只具有反應原性的物質(zhì)。半抗原物質(zhì)多數(shù)為低分子量的化學，例如多糖、多肽、甾體激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核酸、某些藥物（包括抗生素）以及其他化學物品等。半抗原不能直接用作免疫原，只有把這些半抗原和大分子物質(zhì)結(jié)合后，才具有免疫原性，刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞。這種經(jīng)過人工修飾的半抗原稱之為人工抗原，用于偶聯(lián)半抗原的大分子物質(zhì)稱為載體。 一、常用的載體 1、蛋白質(zhì)類 蛋白質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)復雜的膠體兩性化合物，是一種常用的良好載體。其中以白蛋白zui為普遍，這是由于白蛋白具有較高的溶解度，免疫原性強，取材方便。常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白等，以牛血清白蛋白zui為常用。 2、多肽聚合物 多肽聚合物是人工合成的。常見的有多聚賴氨酸，分子量可達十幾萬到幾十萬，是良好的載體。這種多聚物和半抗原結(jié)合后，可刺激動物產(chǎn)生高滴度、高親和力的抗體。多聚賴氨酸可與半抗原的-NH2或-COOH結(jié)合。 3、大分子聚合物 包括羧甲基纖維素、聚乙烯比咯烷酮等。大分子聚合物皆可與半抗原結(jié)合，加入弗氏佐劑可誘導動物產(chǎn)生價的抗體。 二、選擇載體時應考慮以下因素 1、帶有正電荷的堿性蛋白往往是好的免疫源 2、大分子聚合物必須經(jīng)體內(nèi)酶解后才能誘發(fā)反應，不能被分解者如堿性消旋蛋白，阿拉伯膠、D-氨基酸聚合物等不能用做載體 3、當半抗原接在載體上引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變時，才能誘發(fā)半抗原抗體。小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間以"橋"（space bridge）的形式連接。Marks認為，4個碳（C）的"橋"是zui合適的C鏈 4、載體免疫源性的強弱與產(chǎn)生半抗原抗體的水平有關(guān)，但并不是的 5、半抗原與載體蛋白的分子比很重要，一般認為兩者的比為10～20∶1 三、半抗原與載體連接時，應選擇合適的方法，結(jié)合方式的選擇應考慮如下因素 1、半抗原的溶解度和穩(wěn)定性 在結(jié)合反應中應不導致半抗原活性的改變，同時也不能使載體變性至不溶解的程度。 2、結(jié)合鍵的位置 抗體對遠離蛋白質(zhì)聯(lián)接點的半抗原部分有的特異性，故聯(lián)接時應使聯(lián)接鍵遠離半抗原的決定簇。 3、選擇適合的偶聯(lián)試劑 不同的半抗原在偶聯(lián)時，應根據(jù)半抗原的化學結(jié)構(gòu)，以及反應方式選擇適當?shù)呐悸?lián)試劑。如小分子肽類有一定的三級結(jié)構(gòu)，在溶液中依靠氨基酸殘基來維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。因此，用雙功能的亞氨酸酯不但對氨基酸有選擇，而且能代替被取代的每一個ε-氨基的正電荷。蛋白質(zhì)與偶聯(lián)劑接觸后，使不同蛋白質(zhì)分子的功能基團交聯(lián)并凝聚。廣泛交聯(lián)的蛋白質(zhì)，其溶解度常降低，而這種溶解度差的蛋白質(zhì)卻是有效的免疫源。 四、連接方法 半抗原與載體的連接通?？捎梦锢砗突瘜W方法進行。物理吸附的載體有羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，它們借電荷和微孔吸附半抗原?；瘜W法則是利用某些功能基團把半抗原連接到載體上，這些載體包括血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、銅藍蛋白、卵蛋白和人工合成的多聚賴氨酸。帶有游離氨基或游離羧基以及兩種基團都有的半抗原，可直接與載體連接。其他不帶有氨基或羧基的半抗原，須加以適當?shù)母脑?，使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹в杏坞x氨基或游離羧基的衍生物，才能與載體連接。 1、有游離氨基或游離羧基以及兩種基團都有的半抗原與載體的連接方法 （1）碳化二亞胺法 碳化二亞胺是一種化學性質(zhì)非?；钴S的雙功能試劑，它們既可與半抗原上的羧基又可與半抗原上的氨基縮合。 此法非常簡便，只要將半抗原與載體蛋白質(zhì)按一定分子比混合在適當?shù)娜芤褐?，然后加入碳二亞胺，攪拌l～2h，置室溫反應24h，zui后透析除去未反應的半抗原，即可得到人工免疫原。 （2）戊二醛法 戍二醛是帶有兩個活性基團雙功能的連結(jié)劑，它借助兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價鍵連接。 （3）混和酸酐法 混合酸酐法又稱為氯甲基異丁酯法，主要用以甾體激素與蛋白質(zhì)的偶連。以烷基氯甲基為偶連劑，zui常用的是氯甲基異丁酯。含有羧基的半抗原與氯甲基異丁酯反應形成混合酸酐，然后在與蛋白質(zhì)載體上的氨基反應形成肽鍵。 （4）過碘酸氧化法 過碘酸將糖環(huán)氧化成雙醛基，再與蛋白質(zhì)上的氨基偶聯(lián)。本法常用于配糖體類藥物與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。 2、帶有氨基或羧基的半抗原可用下面方法改造后，再用上述方法進行連接 （1）琥珀酸酐法 本法用于帶有羥基的半抗原的改造。琥珀酸酐加水轉(zhuǎn)變成琥珀酸。如將帶有羥基的半抗原和琥珀酸酐在無水吡啶中反應，即可得到帶有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。 （2）羧甲基羥胺法 帶有酮基的半抗原（如孕酮、睪酮）與O-（羧甲基）羥胺反應，轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌铩?/p> （3）重氮化的對氨基苯甲酸法 本法適于帶有酚基的半抗原（如某些藥物）的改造。先將對氨基苯甲酸和亞硝酸鈉反應，反應產(chǎn)物再作用于帶有酚基的半抗原，從而制得帶有羧基的半抗原衍生物。 （4）一氯醋酸鈉 本法適于帶有酚基半抗原的改造。將帶有酚基的藥物與一氯醋酸鈉反應即可得到帶有羧基的半抗原衍生物。 五、人工免疫原的鑒定 1、抗體的特異性 為獲得特異性強的抗體，并不是半抗原分子上任何功能基團都可以用來與蛋白質(zhì)聯(lián)接，也不是毫無選擇的在半抗原分子上添加可以與載體聯(lián)接的功能基團。根據(jù)目前的認識，抗體的特異性主要是針對距蛋白質(zhì)聯(lián)接點zui遠端的半抗原部分。因此，應將對免疫識別來說zui不重要的半抗原部分聯(lián)接到蛋白質(zhì)上。這就是所謂的聯(lián)接半抗原的"遠距離"原則。如雌二醇的特殊功能基團有兩個，即C3-OH和C17-OH。如在C6位與蛋白質(zhì)聯(lián)接，形成E2-6-（O-羧甲基）肟，則所得到的抗血清的特異性就好；如在C17位與蛋白質(zhì)聯(lián)接，形成E2-17-半琥珀酸酯，則所得到的抗血清的特異性就差。前者與雌素酮和雌三醇的交叉廣反應率分別為8.0%和0.3%，而后者分別為100%和10%。在實際聯(lián)接時可用特殊試劑將特異的功能基團封閉，然后進行偶聯(lián)，zui后再將封閉劑去掉。 2、半抗原的取代水平 半抗原聯(lián)接到載體蛋白上的分子數(shù)可影響動物產(chǎn)生抗體的能力。結(jié)合半抗原的多少，依半抗原的性質(zhì)和動物的品種而異。文獻報告每個載體分子只含一個半抗原分子就足以產(chǎn)生半抗原的抗體。一般認為，如以白蛋白為載體，每個白蛋白分子上聯(lián)接5～30個半抗原分子較好。從有利于激發(fā)對半抗原親和力強的抗體產(chǎn)生細胞，聯(lián)接到蛋白質(zhì)上的半抗原數(shù)少一些可能更好。但也有人認為，在免疫后期某些細胞逐漸對半抗原顯示足夠高的親和力，以致能用半抗原-異源載體（即與初始免疫時所用的載體不同）結(jié)合物進行觸發(fā)，此時免疫應答的大小可能部分的與半抗原的取代數(shù)目有關(guān)。 半抗原的取代水平可用放射性示蹤法或分光光度法進行測定。 六、放射性示蹤法 在偶聯(lián)的反應液中加入一定量的放射性標記半抗原。偶聯(lián)反應后經(jīng)充分透析，測量透析袋中的放射性計數(shù)，并計算結(jié)合到載體上的放射性百分數(shù)。這個百分數(shù)指示有同樣百分比的非標記半抗原聯(lián)接到載體上。結(jié)合抗原中半抗原與蛋白質(zhì)的分子比可用下列公式計算： [Pm1 / MW1 ] / [m2 / MW2 ] 其中：P = 放射性百分數(shù)；m1 = 半抗原投入量；MW1 = 半抗原的分子量； m2 = 蛋白質(zhì)的投入量； MW2 = 蛋白質(zhì)的分子量。 七、分光光度法 根據(jù)半抗原的克分子消光系數(shù)估算：配制相同濃度的偶聯(lián)物和純蛋白溶液，分別在同一波長下讀取OD值，然后按下列步驟計算： 半抗原OD值= 偶聯(lián)物OD值－純蛋白OD值 半抗原克分子濃度= 半抗原OD值/ 克分子消光系數(shù) 蛋白質(zhì)濃度= 偶聯(lián)物濃度－半抗原濃度 蛋白質(zhì)克分子濃度= 蛋白質(zhì)濃度/ 蛋白質(zhì)的分子量 [半抗原分子/ 蛋白質(zhì)分子]比值= 半抗原克分子濃度/蛋白質(zhì)克分子濃度 應用本法計算時應注意兩點： 1、讀取OD值可選用任何波長，但偶聯(lián)物與純蛋白的OD值應有盡可能大的差異。即純蛋白的讀數(shù)要盡可能的低，以減少誤差。同時該波長處，半抗原的克分子消光系數(shù)應為已知，否則須先用半抗原的純品通過實驗求出。 2、由于聯(lián)接上了若干分子半抗原，所以偶聯(lián)物的分子量實際大于純蛋白質(zhì)的分子量，故計算的*步有一定的誤差。但蛋白質(zhì)的分子量遠大于半抗原，所以如果波長選擇適當，使蛋白質(zhì)的OD值盡量的小，則這種誤差不會很大。半抗原與載體結(jié)合的數(shù)目與免疫原性密切相關(guān)。一般認為至少要有20個以上的半抗原分子連接到一個載體分子上，才能有效地刺激免疫動物產(chǎn)生抗體。因此，在半抗原與載體連接后，應測定偶聯(lián)到載體上的半抗原量。常用吸收光譜分析法測定，如果半抗原基團有適宜的吸收光譜，測定在一定波長下復合抗原和載體之間克分子吸廣度的差別，然后把這個差別與同樣波長下半抗原的克分子吸光度數(shù)相比較，就可以準確地計數(shù)所結(jié)合的半抗原分子數(shù)。亦可應用同位素標記半抗原滲入法，在偶連反應液中加入一定量的放射性標記的半抗原。偶連反應后經(jīng)充分透析，測量透析袋中的放射性計數(shù)，計算結(jié)合到載體上的半抗原分子數(shù)。 |
