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主營(yíng):ELISA試劑盒,化學(xué)試劑,生物醫(yī)學(xué)試劑,生命科學(xué)科研產(chǎn)品.
 
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒[ELISA Kit]
生物醫(yī)學(xué)試劑
化學(xué)試劑
分子生物學(xué)試劑
抗體庫(kù)
蛋白
細(xì)胞生物學(xué)
Amresco產(chǎn)品
Wako(和光純藥)標(biāo)準(zhǔn)品
實(shí)驗(yàn)室設(shè)備
實(shí)驗(yàn)室耗材
 
 
小鼠髓過氧化物酶特異性抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體IgG(MPO-ANCA IgG)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書
點(diǎn)擊次數(shù):1022 更新時(shí)間:2010-06-28

 

本試劑盒僅供研究使用
zui低檢測(cè)限:1 ng/ml
特異性:本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)小鼠MPO-ANCA (IgG),且與其他相關(guān)抗體無交叉反應(yīng)。
有效期:6個(gè)月
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法半定量測(cè)定小鼠血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中MPO-ANCA (IgG)含量。
說明
1.試劑盒保存:-20℃(較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí));2-8(頻繁使用時(shí))。
2.濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
3.中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處,請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。
4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
實(shí)驗(yàn)原理
用MPO-ANCA抗原包被酶標(biāo)板,制成固相載體。向微孔中先加入待測(cè)樣品進(jìn)行反應(yīng),然后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG進(jìn)行反應(yīng),經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MPO-ANCA (IgG)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),計(jì)算樣品中抗體的效價(jià)(抗血清zui終能顯色的zui高稀釋倍數(shù)記為效價(jià))。
試劑盒組成及試劑配制
1.         酶聯(lián)板(Assay plate ):一塊(96孔)。
2.         樣品稀釋液(Sample Diluent):1×20ml/瓶。
3.         辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG稀釋液 (HRP-anti-mouse IgG Diluent:1×10ml/瓶。
4.         辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG(HRP-anti-mouse IgG:1×120μl/瓶(1:100)。
5.         底物溶液(TMB Substrate:1×10ml/瓶。
6.         濃洗滌液(Wash Buffer:1×20ml/瓶,使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
7.         終止液(Stop Solution:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
 
需要而未提供的試劑和器材
1.         標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.         高速離心機(jī)
3.         電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.         干凈的試管和Eppendof管
5.         系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,一次檢測(cè)樣品較多時(shí),用多通道移液器
6.    蒸餾水,容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存
1.         血清:全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或室溫過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.         血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.         細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
標(biāo)本的稀釋原則:
首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量,確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。稀釋的過程中,應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算抗體效價(jià)時(shí),稀釋了“N”倍,標(biāo)本中抗體的效價(jià)為“N”。
辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG的稀釋原則:
臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG稀釋液稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(每孔100μl),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
操作步驟
實(shí)驗(yàn)開始前,請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?,試劑或樣品稀釋時(shí),均需混勻,混勻時(shí)盡量避免起泡。如樣品濃度過高時(shí),用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。
1.         加樣:分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl,余孔加待測(cè)樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。
2.         棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG工作液 100μl(取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時(shí)內(nèi)配制),37℃,60分鐘。
3.         溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,甩干。
4.         依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光顯色30分鐘內(nèi),此時(shí)肉眼可見孔內(nèi)有明顯藍(lán)色,即可終止)。
5.         依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
6.         用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí),應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,以便試劑集中到管底。
2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,請(qǐng)于2-8℃保存。辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG工作液。
5. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定,以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
計(jì)算
為檢測(cè)樣品中MPO-ANCA (IgG)效價(jià),客戶可以采取樣品2倍倍比稀釋樣品計(jì)算抗體效價(jià),一般采取以1:40為起始稀釋倍數(shù)(使用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋)。zui大稀釋倍數(shù)根據(jù)客戶自身試驗(yàn)要求而定,zui終顯色與陰性對(duì)照孔進(jìn)行比較,有明顯差異的zui大稀釋度定為抗體的zui終效價(jià)。
注意事項(xiàng)
1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩,避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
3. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
4. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高,請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定,計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5. 在配制檢測(cè)溶液工作液時(shí),請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。
6. 底物請(qǐng)避光保存。
7. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
 
 
 
   
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