本試劑盒僅供研究使用 檢測(cè)范圍：15.6 pg/ml - 1000 pg/ml zui低檢測(cè)限：3.9 pg/ml 特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的小鼠BDNF，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。 有效期：6 個(gè)月 預(yù)期應(yīng)用：ELISA 法定量測(cè)定小鼠血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中BDNF 含量。 說明 1．試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。 2．濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。 3．中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。 4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造 成任何影響。 概述 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是1982 年德國神經(jīng)生物 學(xué)家從豬腦中分離出來的小分子蛋白質(zhì)，因豬、大鼠、小鼠和人類的BDNF 具有*相同 的氨基酸編碼序列，且與神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）序列具有驚人的相似性, 故被歸屬為神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族成員。BNDF 是由120 個(gè)氨基酸組成的一種堿性蛋白，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，是由神經(jīng)元的靶細(xì)胞分泌，逆向營養(yǎng)神經(jīng)元，BNDF 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及保護(hù)修復(fù)有重要作用,其生物學(xué)效應(yīng)主要由二種類型的跨膜糖蛋白介導(dǎo)，一種是高親和力受體TrKB，另一種是低親合力神經(jīng)營養(yǎng)素受體（LNGFR），其中TrKB 是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。TrKB 的細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)與BNDF 結(jié)合后可發(fā)生自磷酸化，繼而發(fā)生一系列底物磷酸化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的信息傳遞而引起細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng), TrKB 主要表達(dá)在腦中。目前BDNF 被認(rèn)為是抗凋亡劑、抗氧化劑和鈣通道阻滯劑。 實(shí)驗(yàn)原理 用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗BDNF 抗體的微孔中依次加入標(biāo) 本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗BDNF 抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色 的深淺和樣品中的BDNF 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96 孔）。 2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶（凍干品）。 3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。 4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。 5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。 6. 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100） 7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100） 8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。 10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4） 需要而未提供的試劑和器材 1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀 2. 高速離心機(jī) 3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱 4. 干凈的試管和Eppendof 管 5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器 6. 蒸餾水，容量瓶等 標(biāo)本的采集及保存 1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2 小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g 離心20 分鐘，取上清即 可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 2. 血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g 離心 15 分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本 放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。 標(biāo)本的稀釋原則： 首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn) 曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度 時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上， 然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為1000 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋1000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，15.6 pg/ml，樣品稀釋液 直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15 分鐘內(nèi)配制。 如配制500 pg/ml 標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）1000 pg/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml 樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。 生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則： 臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制 （每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl 生物素標(biāo)記抗體加990μl 生物素標(biāo) 記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則： 臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的 總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和 素加990μl 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi) 配制。 操作步驟 實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。 每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試 劑盒的檢測(cè)范圍。 1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加 標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸 及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120 分鐘。 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl 生物素標(biāo)記 抗體加99μl 生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制）， 37℃,60 分鐘。 3. 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，350μl/每孔，甩 干。 4. 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl，37℃， 60 分鐘。 5. 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，350μl/每孔，甩 干。 6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30 分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4 孔梯度不明顯，即可終止）。 7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量 與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入 終止液。 8. 用酶聯(lián)儀在450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD 值）。在加終止液后15 分鐘以內(nèi) 進(jìn)行檢測(cè)。 注： 1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。 2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。 測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD 值至零。 3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。 4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過 氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn) 品、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。 5. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙， 酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需 要，重復(fù)此過程數(shù)次。 自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。 計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD 值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 注意事項(xiàng) 1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。 2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。 3. 一次加樣時(shí)間控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。 5. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。 6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。 7. 底物請(qǐng)避光保存。 8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。 |
