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本試劑盒僅供研究研究使用
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、唾液、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中MMP-9含量。
概述
    MMP-9基因位于染色體20q11.1~13.1，26~27kbp，具有13個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。哺乳類(lèi)動(dòng)物MMP-9mRNA的同源性約為80%。MMP-9的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)含有活化蛋白（AP）-1、AP-2和刺激蛋白（SP）-1因子結(jié)合位點(diǎn)，人的MMP-9啟動(dòng)子區(qū)還有核因子（NF）κB、ETS結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β抑制元件MMPs主要由3個(gè)*的、保守的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括前肽區(qū)（氨基末端區(qū)）、催化區(qū)和羧基末端區(qū)（類(lèi)血紅素結(jié)合蛋白酶區(qū)）。MMP-9是明膠酶中的一種，除了有MMPs的原型結(jié)構(gòu)外，MMP-9的催化區(qū)還包括3個(gè)重復(fù)的型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域與明膠或彈性蛋白有高度的親和力。MMP-9包含一個(gè)V型的膠原蛋白結(jié)構(gòu)域,這個(gè)結(jié)構(gòu)域有高度的糖基化作用，,它影響底物的特異性以及有抗衰變的作用。MMP-9有許多作用底物，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型膠原、蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等，細(xì)胞因子及其受體也是MMP-9作用的底物。
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中MMP-9水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入MMP-9抗原、生物素化的抗人MMP-9抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MMP-9呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。
試劑盒組成
1.酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2.標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為100 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成100 ng/mL，50 ng/mL ，25 ng/mL，12.5 ng/mL，6.3ng/mL，3.1 ng/mL，1.6 ng/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
3.樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
4.檢測(cè)稀釋液A：1×10ml/瓶。
5.檢測(cè)稀釋液B：1×10ml/瓶。
6.檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A1：100稀釋。
7.檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B1：100稀釋。
8.底物溶液：1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標(biāo)本的采集及保存
1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2．血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。
3.每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
4.每孔加檢測(cè)溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。
5.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。
6.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)。用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。
2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層
吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
    自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。
特異性
    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人MMP-9，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。
計(jì)算
  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng)
1．洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
2．一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
3．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，做復(fù)孔。
4．如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請(qǐng)避光保存。 
說(shuō)明
1．試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。
2．有效期：6個(gè)月
3．濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
4．中、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。