帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。 實(shí)驗(yàn)原理：在pH值為8.0~8.3時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。 實(shí)驗(yàn)步驟： 1． 用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺(tái)上； 2． 調(diào)整好梳子的高度； 3． 稱取0.24 g瓊脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒*溶解，冷卻至45-50篊時(shí)倒入制膠板中； 4． 凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶； 5． 將電泳樣品與溴酚藍(lán)混合后將樣品依次點(diǎn)入加樣孔中； pUC18 5祃 + ddH2O 3祃 + 溴酚藍(lán)2祃 共10祃于0.5ml tube中混合后點(diǎn)樣； 6． 將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動(dòng)； 7． 電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5 礸/ml的溴化乙錠（EB）溶液中染色10－15 min，清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果，并照相記錄。 附注： 1．影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素： 1） DNA分子大小 遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA） 2） 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Kr? 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，?為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb. 3） DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。 4） 所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm 5） 堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 ℃ 6） 嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，（不提倡加在電泳液中） 7） 電泳緩沖液（0.5×TBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的遷移率，無離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。 2．溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量減少臺(tái)面污染。 3．電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenol blue, Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。 |
