膠回收 一. 提高膠回收量的辦法： 1） 增加電泳時(shí)的上樣量。 2） 電泳緩沖液用新鮮配制的。 3） 切膠時(shí)盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率。 4） 把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個(gè)管子，轉(zhuǎn)移到同一個(gè)柱子上。 5） 溶膠時(shí)所加的溶液可多一點(diǎn)，這樣更有利于DNA與膜的結(jié)合，不過一般不要多余750ul。 6） 膠回收的關(guān)鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結(jié)合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；為了使DNA分子更好的攔截在膜上，可以添加30％異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。 7） 加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘），以使乙醇充分揮發(fā)。 8） zui后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50μl洗脫液洗脫（不能太少，否則無法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結(jié)合在膜上的DNA。 9） 可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封4度過夜，第二天再離心回收，效果不錯(cuò)。 10） 將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。 二. 幾種PCR 產(chǎn)物回收的詳方法和步驟 1） 普通膠回收 如果要膠回收，還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實(shí)在要手工回收，可以切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干凈，乙醇沉淀即可。另外好像還有冷凍法，沒作過，不是很清楚。 2） 從低熔點(diǎn)凝膠回收DNA 純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分鐘保溫，使凝膠*溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000rpm，3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解，測(cè)定含量，備用（可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析，探針制備等）。 3） 擴(kuò)增特異性好的PCR回收 如果PCR擴(kuò)增特異性好，只是簡(jiǎn)單的PCR產(chǎn)物純化回收，可以在PCR產(chǎn)物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1體積的醋酸鈉，2.5體積的無水乙醇沉淀回收。 三. 不需膠回收就可直接連接的方法 1） 低溫冷凍析出法 跑電泳時(shí)用低熔點(diǎn)的agarose膠，跑到一定時(shí)候，將目的條帶所在的那一段膠切下，盡量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且，把底下沒有脫氧核酸的那點(diǎn)膠也盡量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在負(fù)75度冰箱中10－30分鐘，接著1，300rpm離心5－10分鐘，取10ul上清，加入連接體系中。將其余的液體也吸出，儲(chǔ)存在另一個(gè)管子中，做好標(biāo)記，放在－20度備用。 2） 酶切后的直接連接 在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進(jìn)行連接是可以篩選出連接好的片斷的. 四、一些注意事項(xiàng) 1.電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺(tái)子清理干凈，刀片洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源DNA污染。 2.切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對(duì)比較薄的膠來做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。 3.關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果你戴樹脂眼鏡就可以了。 4.瓊脂糖對(duì)回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液，保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環(huán)境中（如果用柱子的話）。對(duì)于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%異丙醇。 5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過夜浸泡，即可。當(dāng)然你要將100bp在膠中位置定好切下。已標(biāo)記的探針用X片，未標(biāo)記的用EB。 6.選用回收效率較高的柱子，比如進(jìn)口的Qiaquick spin column。 7.參照分子克隆用低熔點(diǎn)膠回收。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。 附注： 1．影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素： 1）DNA分子大小 遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA） 2） 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，t為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb. 3）DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。 4）所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm 5）堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 ℃ 6）嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，（不提倡加在電泳液中） 7）電泳緩沖液 （0.5×TBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的遷移率，無離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。 2．溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量減少臺(tái)面污染。 3．電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenol blue, Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。 |
