單克隆抗體的生產(chǎn)、提純、鑒定與保存 （一） McAb的生產(chǎn)在建立雜交瘤細胞株后，可在體外大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單克隆抗體，以旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法為佳。先將細胞用一般靜止培養(yǎng)法在5%小牛血清培養(yǎng)基中適應(yīng)2～3天。將30ml生長旺盛的細胞移至旋轉(zhuǎn)瓶中，加入70ml 25%小牛血清培養(yǎng)液，充以10%CO2的空氣，蓋緊，37℃靜置1～2天后，打開蓋，加700ml 25%小牛血清培養(yǎng)液，再蓋緊，37℃慢速（1 r/min）旋轉(zhuǎn)，每天打開1次蓋，讓10%CO2通過一濾菌網(wǎng)與瓶內(nèi)氣體進行交換，當(dāng)細胞不再生長，1～2天后收集培養(yǎng)液，離心，將上清液保存。用這種方法制備單克隆抗體，比較麻煩，抗體的含量較低。 目前一般多用小鼠腹腔接種的方法進行McAb的制備，這種抗體的效價往往高于培養(yǎng)細胞上清液的100～1000倍。方法是：取已成年的BALB/c小鼠，于腹腔內(nèi)注入液體石蠟或降植烷0.5ml，1周后，再于腹腔內(nèi)注入雜交瘤細胞3×105/05ml，10天左右即形成腹水。待小鼠腹腔明顯脹大，用75%酒精消毒腹部，用7號注射針頭刺入腹腔下部，然后輕按腹部，使腹水自然滴出，一次可收得約5ml，多者10ml以上，間隔了2天后，可再次抽取，如此反復(fù)直至小鼠死亡。抽取的腹水，離心10min，取上清液保存。沉淀中的細胞可再給另外小鼠注射，其形成腹水的速度比原細胞快。為多獲得腹水，應(yīng)選擇雌性小鼠，體重以重者為優(yōu)。 （二） McAb的提純不論是培養(yǎng)上清液還是腹水，如果用于診斷試驗或ELISA等，不需再提純，如分析抗體的蛋白均一性，或做蛋白定量，則應(yīng)進一步純化，以除去培養(yǎng)液、宿主及克隆細胞本身的一些無關(guān) 蛋白質(zhì)。提純方法與一般Ig的提純方法相同。 （三） McAb的保存由于McAb對環(huán)境因素敏感，其穩(wěn)定性遠不如常規(guī)抗體， 如有的McAb經(jīng)凍干后*失效。培養(yǎng)上清液加01%的疊氮鈉防腐劑，4℃可保存數(shù)月，由于有小牛血清，不需另加保護蛋白，腹水分裝，于-20℃或-70℃長期凍存，用時以含1%BSA，01%的疊氮鈉的PBS稀釋，其中BSA為保護蛋白，起穩(wěn)定作用，在4℃還可保存數(shù)月，切忌反復(fù)凍融。提純的McAb，加入1%BSA分裝后凍存。 單克隆抗體的鑒定 （一） McAb Ig類別及亞類鑒定方法是用兔抗小鼠各種類別及亞類的Ig抗血 清與培養(yǎng)上清液進行免疫雙擴散試驗，根據(jù)出現(xiàn)的沉淀線來確定。由于培養(yǎng)上清液中抗體濃 度較低，不易出現(xiàn)沉淀線，應(yīng)先濃縮5～10倍。也可用多次加樣的方法。 （二） McAb的其他性狀鑒定必要時，可針對抗原決定基的屬性、特異性、 親和力及其他生物學(xué)特性進行鑒定。 |
