Fab片段抗體表達(dá)產(chǎn)物的純化和鑒定 1抗Fab片段抗體親和層析純化法 （1）偶聯(lián)抗人或抗鼠Fab片段抗體到Protein G Sepharose,將純化的抗人或鼠Fab片段抗體以2mg/ml的比例與Protein G Sepharose凝膠珠溶液混合，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1h。用10倍量的02mol/L硼酸鈉（pH值90）洗兩次，4 000r/min離心5min，用10倍量的02mol/L pH值90硼酸鈉溶液，重懸凝膠珠子，加入足夠量的DMP（dimethylpimelimide,Sigma公司）至終濃度為20mmol/L左右，室溫旋轉(zhuǎn)混合孵育30min后，離心去上清，加入02mol/L乙醇胺終止反應(yīng)。繼續(xù)在乙醇胺溶液中封閉2h，用PBS清洗數(shù)次，用PBS懸起來后制備2ml親和凝膠柱。 （2）100ml IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的Fab片段菌液，4℃ 4 000r/min離心15min。用pH值72的PBS 10ml懸起沉淀物，反復(fù)凍融三次，12 000r/min 4℃離心20min,取上清，過045μm濾膜，收集濾過溶液。 （3）用50mmol/L pH值70 PBS結(jié)合緩沖液平衡上述親和層析柱。 （4）加入步驟2中濾過的Fab片段抗體粗制品于柱中，反復(fù)循環(huán)30min至1h。 （5）加5~10ml 10mmol/L pH值68的PBS預(yù)洗緩沖液，洗去非特異性吸附蛋白。 （6）加入8ml 100mmol/L pH值27的甘氨酸鹽酸緩沖液洗脫結(jié)合的Fab片段蛋白，每管收集1ml。 （7）于收集管中加入50~80μl 1mol/L pH值90的TrisHCl緩沖液中和洗脫下來的溶液，置于4℃待測(cè)定蛋白含量。 （8）將含有蛋白高峰管合并，加入Amicon濃縮柱，根據(jù)商家手冊(cè)離心濃縮。 （9）對(duì)純化濃縮后的Fab片段蛋白10~20μg進(jìn)行SDSPAGE電泳，用125%聚丙酰胺凝膠，常規(guī)SDSPAGE電泳條件。對(duì)于鼠Fab片段抗體，由于輕鏈和重鏈分子量類似，故在25kD左右獲一條帶。對(duì)于人Fab片段抗體，如果λ鏈和Fd鏈的組合，可能獲兩條鏈，25kD左右的為Fd鏈，28kD左右的為λ鏈。 2.Protein ASepharose柱層析純化法Protein ASepharose可用于純化來源于VH3免疫球蛋白家族的重組抗體。 （1）用PBS浸泡Protein ASepharose。 （2）用50ml PBS將Protein ASepharose裝成2ml柱子。 （3）將制備好的抗體溶液上樣。 （4）用下列5倍體積量的溶液依次洗柱子：PBS、PBS05mol/L NaCl、02mol/L甘氨酸（pH值60）、02mol/L甘氨酸（pH值50）。 （5）用3倍柱床體積的02mol/L甘氨酸（pH值30）洗脫液洗脫，每管收集1ml，加200ml 1mol/L TrisHCl（pH值74）中和。 （6）將洗脫下來的抗體對(duì)PBS透析過夜。 3金屬離子親和層析柱純化法此方法可用于帶有6個(gè)組氨酸的重組抗體。 （1）抗體溶液制備，如從上清中收獲抗體片斷，10 000r/min離心15min,用PEG濃縮或用超濾膜濃縮（SterivexHV 045μm,Minipore公司，美國）。如從膜間隙收獲抗體片斷，則將菌液10 000r/min離心15min，用原菌量1/20體積的TE葡萄糖緩沖液（30mmol/L Tris pH值70，20%葡萄糖，1mmol EDTA）重懸沉淀，置冰浴20min，12 000r/min離心15min，重懸沉淀于1/20量的5mmol MgSO４中，冰浴20min,12 000r/min離心15min。 （2）將抗體溶液對(duì)上樣緩沖液（50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH值75，500mmol/L NaCl,20mmol/L咪唑）以4mol/L濃度透析過夜。 （3）用5ml NiNTA懸液（Qiagen,德國）填充層析柱。 （4）用50ml上樣緩沖液平衡柱子。 （5）將抗體溶液加入柱中。 （6）用清洗緩沖液（50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH值75，500mmol/L NaCl,35mmol/L咪唑）洗去非特異性吸附蛋白。 （7）用洗脫液（50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH值75，500mmol/L NaCl,100mmol/L咪唑）洗脫，每管收集1ml組分，共4~10ml。 （8）將抗體組分對(duì)PBS透析以去除咪唑和高濃度氯化鈉。 （9）用復(fù)原緩沖液（50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH值75，500mmol/L NaCl,250mmol/L咪唑）清洗柱子后，用上樣緩沖液（50mmol/L磷酸鹽緩沖液pH值75，500mmol/L NaCl,20mmol/L咪唑）平衡柱子。 4Fab抗體的特異性鑒定對(duì)于所獲的Fab片段抗體，對(duì)某種特異性抗原的特異性鑒定，根據(jù)其所針對(duì)的抗原不同，則采用的方法也不同。主要方法有： （1）Fab片段抗體對(duì)同位素S３５標(biāo)記抗原的特異性放射免疫沉淀，適用于構(gòu)象依賴或非構(gòu)象依賴的抗原。在此試驗(yàn)中，所用Sepharose 4B珠子需偶聯(lián)相應(yīng)的抗人或抗鼠Fab抗體，除了特異性的 蛋白帶外，結(jié)果通常還會(huì)出現(xiàn)一條70kD左右的非特異性條帶。 （2）對(duì)特異性抗原的Westernblot鑒定，適用于一些非構(gòu)象依賴的線性抗原。 |
